Der Filmtitel gibt Ort, Tag, Monat, Jahr und Stunde des einzigen jemals gelungenen Aufstands in einem Vernichtungslager der Nationalsozialisten an. An diesem 14. Oktober 1943, Punkt 16 Uhr, spaltete der damals sechzehnjährige Jude Yehuda Lerner dem SS-Offizier Greischütz mit einer Axt den Schädel. Lerners Tat war der Auftakt zur einzigen erfolgreichen Revolte, in deren Verlauf elf SS-Männer getötet wurden und mehrere Hundert Häftlinge fliehen konnten. Das Lager Sobibor, in dem seit Frühjahr 1942 mehr als 250.000 Menschen vergast worden waren, wurde danach von den Nationalsozialisten aufgegeben.
Geplant, vorbereitet und organisiert hatte den Aufstand ein jüdischer Sowjetoffizier, Alexander Petscherski, ein Berufssoldat, in nicht einmal sechs Wochen. Petscherski, der Anfang September zusammen mit anderen Juden, ebenfalls Soldaten der Roten Armee, nach Sobibor deportiert wurde, hatte das Glück, nicht sofort in die Gaskammern geschickt zu werden wie seine übrigen Kameraden. Er gehörte zu ungefähr sechzig Männer, die für Schwerarbeit und Instandhaltungsmaßnahmen dringend gebraucht wurden.
Lanzmann geht es nicht um eine historische Rekonstruktion des Aufstands. Sobibor, 14. Oktober 1943, 16 Uhr ist vielmehr die Geschichte Yehuda Lerners. Seine Familie wurde in Treblinka ermordet, ihm gelang neunmal die Flucht aus unterschiedlichen Lagern. Verschmitzt erzählt Lerner, wie die Aufständigen die SS mit ihren Mitteln zu schlagen – mit ihrer Pünktlichkeit. Der Plan, die SS-Männer unter vorgeschobenen Terminen einzeln im Fünf-Minuten-Takt zu verschiedenen Baracken zu bestellen ging auf. Um 15.55 Uhr wird in der Nebenbaracke ein SS-Wachmann mit einer Axt erschlagen, um 16.00 Uhr erledigt Lerner den nächsten, weitere fünf Minuten später ein Kamerad den nächsten. Yehuda Lerners Erzählung endet damit, dass er auf der Flucht im Wald einschläft - 500 Meter vom Lager entfernt.